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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 263 (2023) Citar este artículo

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El cierre del tubo neural (NTC) es un proceso complejo de desarrollo embrionario que involucra mecanismos moleculares, celulares y biomecánicos. Si bien los factores genéticos y la señalización bioquímica se han investigado ampliamente, el papel de la biomecánica tisular sigue sin explorarse debido a la falta de herramientas. Aquí, desarrollamos una modalidad óptica que puede realizar imágenes mecánicas de lapso de tiempo del tejido de la placa neural a medida que el embrión experimenta la neurulación. Esta técnica se basa en la combinación de un microscopio Brillouin confocal y un cultivo ex ovo modificado de embrión de pollo con una incubadora en el escenario. Con esta técnica, por primera vez, capturamos la evolución mecánica del tejido de la placa neural con embriones vivos. Específicamente, observamos el aumento continuo en el módulo tisular de la placa neural durante la NTC para embriones cultivados ex ovo, lo cual es consistente con los datos del cultivo in ovo, así como con estudios previos. Más allá de eso, encontramos que el aumento en el módulo del tejido estaba altamente correlacionado con el engrosamiento y la flexión del tejido. Prevemos que esta técnica sin contacto y sin etiquetas abre nuevas oportunidades para comprender los mecanismos biomecánicos en el desarrollo embrionario.

El cierre del tubo neural (NTC, por sus siglas en inglés) es un procedimiento central de neurulación de vertebrados en el que la placa neural plana se elevará y fusionará para formar un tubo neural hueco. Una falla de este procedimiento puede resultar en defectos severos del tubo neural, que representan uno de los defectos congénitos humanos más comunes1. Los procesos genéticos y moleculares que guían la NTC se han estudiado ampliamente durante muchas décadas2,3,4. Por otro lado, los mecanismos biomecánicos que pueden estar involucrados en NTC están atrayendo cada vez más atención en los últimos años5,6,7. A nivel celular y tisular, la morfogénesis del tubo neural puede considerarse como resultado de la interacción entre la fuerza generada y la resistencia mecánica del tejido embrionario8,9: el cierre exitoso del tubo neural requiere que la fuerza intrínseca pueda superar la tensión del tejido opuesto que se basa en su propiedad elástica. Como tal, la alteración de la biomecánica tisular puede causar fallas en el cierre y por lo tanto malformación del tubo neural10. Aunque la producción de fuerza y ​​el cambio mecánico del tejido durante el procedimiento de NTC se han observado en experimentos10,11,12, la contribución cuantitativa de procesos biomecánicos específicos para garantizar una neurulación sólida sigue siendo desconocida. Una de las principales razones es la falta de herramientas que puedan mapear la biomecánica del tejido de la placa neural in situ y en tiempo real cuando el embrión se está desarrollando.

Se han desarrollado muchas técnicas importantes para cuantificar las propiedades mecánicas del tejido embrionario13, que se pueden clasificar aproximadamente en tres categorías: (1) técnicas basadas en contacto, incluida la microscopía de fuerza atómica (AFM)14,15 o hendiduras basadas en microcantilever11,16,17 para medir el módulo de Young aparente en una escala de nm a µm, la aspiración con micropipeta para medir la tensión del tejido en una escala de µm18 y la prueba de tracción del tejido en una escala de ~mm19. Si bien las técnicas basadas en contacto pueden proporcionar una cuantificación directa de las propiedades viscoelásticas del tejido en condiciones cuasiestáticas o de baja frecuencia, necesitan acceso físico a la muestra y necesitan aplicar fuerza para deformar la muestra durante la medición. Dado que el tejido del tubo neural tiene una forma irregular en 3D y está interconectado mecánicamente, generalmente se requieren explantes aislados para pruebas mecánicas inequívocas. (2) Sensores basados ​​en perlas/gotas, incluidas pinzas ópticas/magnéticas20,21 y microgotas22. La pinza óptica/magnética utiliza perlas rígidas impulsadas por la fuerza (~ µm de diámetro) para detectar las propiedades reológicas del tejido localizado, y la microgota utiliza gotas deformables (de 4 a 80 µm de diámetro) para cuantificar la tensión del tejido. Estos sensores pueden medir cuantitativamente las propiedades mecánicas con resolución subcelular o celular después de una cuidadosa calibración. Sin embargo, requieren la inyección de perlas o gotitas en el tejido, lo que los hace invasivos y de bajo rendimiento. (3) Ablación/disección de tejido. Este método utiliza un rayo láser pulsado ultrarrápido10 o una cuchilla23 para diseccionar una porción del tejido y evaluar la tensión del tejido en función de la respuesta de relajación. Esta es una técnica atractiva debido a la configuración simple. Sin embargo, debido a la conexión mecánica del tejido embrionario en 3D, este método proporciona principalmente una evaluación global en una escala relativamente grande (tamaño de ~ 100 μm a ~ mm). En resumen, los métodos existentes pueden cuantificar varios aspectos de las propiedades mecánicas de la célula y el tejido con diferentes escalas espaciales y temporales y han avanzado mucho en la evaluación de la biomecánica del tejido embrionario. Sin embargo, debido a las limitaciones técnicas, no se ha informado sobre el mapeo mecánico in situ del tejido de la placa neural durante el procedimiento de NTC en embriones vivos.

La microscopía confocal de Brillouin es una técnica emergente para cuantificar las propiedades mecánicas de los materiales biológicos24,25,26. A diferencia de los métodos de prueba mecánicos convencionales, la microscopía de Brillouin utiliza un rayo láser para medir las propiedades elásticas del material. Esto se basa en un fenómeno óptico llamado dispersión espontánea de la luz de Brillouin27, donde la interacción del rayo láser incidente y el fonón acústico inherente dentro del material introducirá un cambio de frecuencia (es decir, un cambio de Brillouin) en la luz dispersada (ver "Métodos"). . Al medir el cambio de Brillouin de la luz dispersada con un espectrómetro personalizado, se puede cuantificar directamente el módulo elástico longitudinal del material. Dado que el microscopio Brillouin está diseñado en una configuración confocal, puede lograr una resolución espacial limitada por difracción. En los últimos años, innovamos esta técnica y demostramos su viabilidad para cuantificar las propiedades mecánicas de una sola célula28,29, tejido embrionario30 y placa neural31 con resolución subcelular y suficiente sensibilidad mecánica. Como técnica completamente óptica, el microscopio Brillouin puede medir la biomecánica sin contacto, no invasivo y sin etiquetas. Por lo tanto, podría ser una herramienta prometedora para mapear las propiedades elásticas del tejido de la placa neural in situ durante el desarrollo embrionario.

En este trabajo, desarrollamos una modalidad óptica que puede realizar imágenes mecánicas de lapso de tiempo de NTC en embrión de pollo. Para hacerlo, integramos un microscopio Brillouin confocal con una incubadora en el escenario para el cultivo ex ovo modificado. El cultivo ex ovo asegura que el embrión se desarrolle continuamente durante 21 h, cubriendo los eventos completos de NTC. En comparación con el cultivo in ovo, en el que el embrión se desarrolla dentro de una cáscara de huevo opaca, el cultivo ex ovo proporciona una accesibilidad óptica superior y, por lo tanto, permite obtener imágenes Brillouin y de campo claro en tiempo real durante el desarrollo del embrión. Luego usamos la microscopía de Brillouin para adquirir continuamente imágenes mecánicas 2D del tejido de la placa neural craneal a medida que el embrión experimentaba la neurulación. Con esta modalidad, observamos un claro aumento en el cambio de Brillouin promedio del tejido de la placa neural durante el NTC del embrión de pollo cultivado ex ovo, lo cual es consistente con los resultados del sistema de cultivo in ovo. Es importante destacar que encontramos que el aumento en el módulo del tejido en el eje dorsal-ventral estaba fuertemente correlacionado con el engrosamiento de la placa neural, así como con el ángulo de cierre, lo que indica que la mecánica del tejido puede sincronizarse con el cambio geométrico de la placa neural para lograr un cierre exitoso del tubo neural. Juntos, esta modalidad de imagen mecánica de lapso de tiempo puede proporcionar nuevos datos para comprender los mecanismos biomecánicos durante la neurulación embrionaria.

Se realizaron imágenes mecánicas 2D de lapso de tiempo en un microscopio Brillouin invertido (Fig. 1a) (ver "Métodos"). Por definición, el cambio de Brillouin está relacionado positivamente con el módulo longitudinal por las propiedades del material, incluido el índice de refracción \(n\) y la densidad \(\rho\). Para los materiales biológicos, se encuentra que la relación entre el índice de refracción y la densidad \(\rho /{n}^{2}\) es aproximadamente constante durante los procesos fisiológicos24,32. Por lo tanto, aquí usamos el cambio de Brillouin para interpretar el cambio relativo del módulo longitudinal. En el cultivo ex ovo modificado, el embrión se colocó en una placa de Petri con el lado dorsal hacia abajo (Fig. 1b). Luego, el plato se colocó en la incubadora en el escenario para mantener el desarrollo del embrión (> 21 h). Las imágenes de campo claro con lapso de tiempo sugieren que los embriones del cultivo ex ovo se han desarrollado con un ritmo de tiempo similar al del cultivo in ovo (Figs. complementarias S1–S2).

Esquema de la configuración. (a) Microscopio Brillouin confocal con incubadora en platina. Placa de cuarto de onda QWP, divisor de haz polarizado PBS, acoplador de fibra FC. (b) Placa portadora para cultivo ex ovo. La vista lateral (superior) y la vista superior (inferior) muestran todos los componentes, incluido el embrión dentro del portador.

Para excluir cualquier impacto potencial del cultivo ex ovo y la iluminación láser en la mecánica tisular de la placa neural, recolectamos embriones cultivados in ovo (N = 46) en diferentes etapas de Hamburger Hamilton (HH) (HH 6 a HH 12) y adquirió imágenes mecánicas 2D de la sección transversal perpendicular al eje anteroposterior (cerca de la región craneal). Las imágenes representativas de Brillouin sugieren que la placa neural del embrión en las etapas posteriores de HH tiene un mayor cambio de Brillouin que las etapas anteriores (Fig. 2a-d). Luego cuantificamos el cambio de Brillouin promedio de la región de la placa neural en una ubicación similar del eje anterior-posterior para todos los embriones recolectados. Observamos que el cambio de Brillouin de la placa neural mostró un claro aumento de HH 6 a HH 9 + y aproximadamente mantuvo su valor después (Fig. 2e). La placa neural del embrión en etapa tardía (es decir, HH 12) tiene un cambio de Brillouin promedio de 6,353 GHz, que es 0,126 GHz más alto que el de los embriones en etapa temprana (es decir, HH 6), lo que corresponde a un aumento de ~ 60 % de la de Young. módulo de acuerdo con la relación empírica entre el módulo longitudinal y el módulo de Young obtenido de las celdas28 (ver "Métodos").

Resultados de embriones cultivados in ovo. (a–d) Imágenes representativas de Brillouin del tejido del tubo neural craneal de cuatro embriones en diferentes etapas HH: (a) HH 6, (b) HH 8, (c) HH 11, (d) HH 12. La línea discontinua roja describe el región de la placa neural. ( e ) Los cambios promedio de Brillouin de la placa neural craneal de los embriones revelan un aumento continuo en el módulo del tejido contra la etapa de desarrollo. Número de embriones: 46. Cada punto representa el cambio de Brillouin promedio de un embrión. La barra de escala es de 50 µm.

Para capturar la evolución mecánica de la placa neural durante todo el procedimiento de NTC, realizamos un mapeo mecánico de lapso de tiempo de embriones cultivados ex ovo. El embrión se cultivó de forma continua durante más de 14 h (Fig. S3 complementaria), dentro de las cuales se adquirió la imagen de Brillouin con lapso de tiempo de la sección transversal de la placa neural en la región del rombencéfalo/cervical (Fig. 3a) en el tercer par de somitas a lo largo de la placa neural en desarrollo (Fig. S3 complementaria). Los resultados muestran que el cambio de Brillouin promedio de la placa neural aumenta continuamente con el tiempo de cultivo (Fig. 3b), lo cual es consistente con el resultado de los embriones cultivados in ovo. Los experimentos repetidos (N = 9) sugieren que el aumento en el cambio de Brillouin de la placa neural durante NTC es un fenómeno común para los embriones de pollo (Fig. 3d). Específicamente, el cambio de Brillouin de la placa neural aumentó significativamente de HH 8- a HH 9 y tuvo cambios menores después. En el punto final del cultivo ex ovo (HH 10), las placas neurales tienen un cambio de Brillouin promedio de 6,336 GHz, que es 0,097 GHz más alto que el de la etapa más temprana (HH 8-), lo que corresponde al aumento relativo de ~ 46 % en términos del módulo de Young. Esto es consistente con el resultado de los embriones cultivados in ovo, lo que confirma que el cultivo ex ovo y la iluminación con láser no afectaron la evolución mecánica del tejido de la placa neural durante el desarrollo embrionario.

Imágenes de Brillouin de lapso de tiempo de embriones cultivados ex ovo. ( a ) Imágenes de Brillouin de lapso de tiempo de un embrión representativo durante 14 h. (b) El cambio promedio de Brillouin del tejido de la placa neural del embrión en (a) aumenta con el tiempo de cultivo. (c) El grosor del tejido de la placa neural del embrión en (a) aumenta con el tiempo de cultivo. ( d ) Se observa un aumento en el cambio de Brillouin contra la etapa de desarrollo para todos los embriones (N = 9). ( e ) Se observa engrosamiento del tejido contra la etapa de desarrollo para todos los embriones. ( f ) Correlación entre el cambio de Brillouin promedio y el grosor del tejido de la placa neural. Los símbolos representan diferentes embriones. Número de mediciones: 39. Se utiliza la prueba t de dos muestras para cuantificar la significación estadística. *p = 0,008; **p = 0,012; ***p = 0,049; **** p = 0,01. La barra de escala es de 50 µm.

Utilizando la mecánica de tejidos como mecanismo de contraste en las imágenes de Brillouin, también podemos cuantificar los cambios morfológicos de la placa neural durante NTC. Aquí, medimos el grosor promedio de los dos sitios que es el medio de la distancia entre el punto de articulación mediano y las puntas neurales (Fig. 3c). De acuerdo con la literatura publicada2,33, observamos un engrosamiento cuádruple de la placa neural desde HH 8- (~ 13 µm) hasta HH 9 (~ 52 µm) (Fig. 3e). Curiosamente, encontramos que el engrosamiento del tejido y el aumento del módulo tisular exhiben tendencias muy similares durante el procedimiento de NTC. Luego trazamos el cambio de Brillouin contra el grosor de todos los embriones cultivados ex ovo y encontramos una fuerte correlación (\(p<1\times {10}^{-6}\)) entre el aumento del cambio de Brillouin y el engrosamiento del tejido. (Figura 3f). Estos datos sugieren que el aumento en el módulo longitudinal del tejido y el engrosamiento del tejido son probablemente eventos coordinados temporalmente durante la NTC.

NTC es un proceso biomecánico complejo de modelado y modelado de tejidos que está impulsado por la fuerza y ​​las propiedades mecánicas del tejido. Por lo tanto, es fundamentalmente necesario comprender la relación entre la mecánica tisular y la geometría. Aquí, observamos empíricamente cómo el aumento en el módulo del tejido se coordina con el cambio geométrico de la placa neural. De acuerdo con las imágenes de Brillouin, definimos el ángulo de cierre \(\beta\) como la intersección de los lados izquierdo y derecho de la placa neural en el punto de bisagra medio (Fig. 4a). Según la definición, \(\beta =180^\circ\) y 0° representan que la placa neural es plana y completamente cerrada, respectivamente. A continuación, distribuimos embriones cultivados ex ovo (etapas de desarrollo entre HH8- y HH10) en cada intervalo de 10º y calculamos los valores promedio para cualquier intervalo que tuviera múltiples embriones. Luego trazamos el desplazamiento de Brillouin \({\omega }_{B}\) contra el ángulo de cierre \(\beta\) (Fig. 4b). Los datos se pueden ajustar bien mediante una curva empírica simple \({\omega }_{B}=A\cdot \mathrm{exp}\left(B\cdot \beta \right)+C\), con parámetros ajustados \ (A=-0.024, B=7.85\times {10}^{-3},\) \(C=6.348\), y el coeficiente de ajuste \({R}^{2}=0.67\). Esta correlación positiva sugiere que el aumento del módulo tisular probablemente esté sincronizado con la flexión de la placa neural durante el procedimiento de NTC. Tenga en cuenta que este análisis no consideró los embriones anteriores a HH 8 o posteriores a HH 10, en cuyas etapas la mecánica del tejido podría ser diferente para el mismo ángulo de cierre (180° o 0°). Dado que el microscopio de Brillouin tiene una configuración confocal, el ángulo de dispersión no se verá afectado por la flexión de la placa neural; por lo tanto, excluimos los artefactos potenciales introducidos por la flexión del tejido al aumento observado en el cambio de Brillouin. Se necesita más investigación para comprender el mecanismo biológico subyacente que coordina el aumento del módulo y la flexión del tejido.

El aumento de Brillouin Shift se correlaciona con la flexión del tejido para embriones cultivados ex ovo. (a) Definición del ángulo de cierre. (b) El ángulo de cierre se correlaciona con el cambio de Brillouin promedio de la placa neural. Se recopilan datos de embriones en etapas de desarrollo de HH 8- a HH 10. \(\beta =180^\circ\) y 0° representa que la placa neural es plana y completamente cerrada, respectivamente. Los embriones se distribuyen en cada intervalo de 10° en función del ángulo de cierre. El punto de datos representa el valor promedio de los embriones dentro del mismo intervalo. La barra de error representa la desviación estándar. La curva sólida es el resultado apropiado de una función empírica.

Aquí, desarrollamos una modalidad óptica para el mapeo mecánico de lapso de tiempo de embriones de pollo vivos. Esta modalidad se basa en la combinación de un microscopio Brillouin confocal y un sistema de cultivo ex ovo modificado, que tiene resolución subcelular y suficiente sensibilidad mecánica. A diferencia de las técnicas convencionales para pruebas mecánicas, nuestro método utilizó un rayo láser enfocado para cuantificar la mecánica del tejido, haciéndolo sin contacto, no invasivo y sin etiquetas. Confirmamos que el cultivo ex ovo y la iluminación láser no perturbaron el desarrollo del embrión. Demostramos la viabilidad de esta técnica mediante la adquisición de imágenes mecánicas 2D de la placa neural in situ a medida que el embrión experimentaba la neurulación. Encontramos que el tejido de la placa neural experimentó un aumento continuo en el módulo tisular durante NTC. La rigidez del tejido durante la neurulación se ha informado anteriormente en otras especies. Por ejemplo, el módulo elástico del neuroepitelio de los embriones de ajolote aumentó en un pliegue desde la etapa 13 hasta la etapa 1519. Además, se ha observado que el tejido neural dorsal en el embrión temprano de Xenopus aumentó casi 4 veces desde la etapa 11.5 hasta la etapa 2111. Recientemente , los estudios preliminares en embriones de ratón sugieren un aumento de hasta un 80 % en el módulo tisular durante la neurulación por microscopía de Brillouin31,34. Aunque estos datos no son directamente comparables con este trabajo debido a las diferencias en las especies y/o las técnicas utilizadas, la tendencia similar observada en los embriones de pollo sugiere que la biomecánica del tejido puede desempeñar un papel importante durante la NTC en todas las especies. Es probable que el aumento del módulo tisular se deba al aumento de la densidad celular y/o la acumulación de contractilidad de la actomiosina10,11,15, lo que debería investigarse en el trabajo futuro. Más allá de eso, observamos que el aumento en el módulo del tejido está fuertemente correlacionado con el engrosamiento y la flexión del tejido.

La neurulación es un proceso complejo que involucra actividades celulares, moleculares y biomecánicas9,36. Si bien la regulación genética y la señalización bioquímica se han investigado ampliamente, el mecanismo biomecánico está menos explorado y el vínculo subyacente entre las actividades celulares/moleculares microscópicas y la morfogénesis macroscópica se desconoce en su mayoría5. Dado que nuestra técnica totalmente óptica puede cuantificar directamente la mecánica tisular 2D/3D dentro de embriones vivos intactos, potencialmente puede abrir nuevas oportunidades para comprender mejor el papel de los mecanismos biomecánicos en el procedimiento de NTC. Por ejemplo, un par de actividades celulares cruciales que incluyen la extensión convergente37, la constricción apical38 y la migración nuclear intercinética39,40 pueden coordinar juntas el aumento observado en el desplazamiento, el engrosamiento y la flexión de Brillouin. La resolución subcelular del microscopio Brillouin permitirá a los investigadores seguir investigando el papel de estos comportamientos celulares en la regulación de la biomecánica tisular. Por otro lado, las señales mecánicas pueden guiar los comportamientos celulares y los destinos celulares a través de la mecanotransducción durante el desarrollo embrionario36,41; por lo tanto, la técnica puede ayudar a comprender la interacción entre la señalización bioquímica y las señales biomecánicas. Además, el cierre del tubo neural es impulsado físicamente tanto por la fuerza generada como por la resistencia mecánica del tejido10,12,42. La cuantificación in situ de las propiedades mecánicas puede ayudar a desacoplar los roles de la fuerza y ​​la mecánica tisular y así permitir una mejor aclaración de las interacciones biomecánicas. Además, el modelado computacional es una poderosa herramienta para comprender el mecanismo de la morfogénesis43,44,45. Las imágenes mecánicas de lapso de tiempo del tejido de la placa neural adquiridas por nuestra técnica pueden proporcionar nuevos datos de entrada para la simulación de la neurulación.

Los defectos del tubo neural (DTN) se encuentran entre las enfermedades congénitas humanas más comunes y están reguladas por factores genéticos y ambientales46,47. A nivel tisular, los defectos del tubo neural surgen de la falla física del tubo neural debido a la interacción anormal de la generación de fuerza y ​​las propiedades mecánicas del tejido embrionario. Un trabajo reciente sugiere que el NTD inducido por la mutación genética está asociado con la biomecánica tisular alterada10. Por lo tanto, una herramienta cuantitativa para medir la mecánica tisular debería permitir a los investigadores atribuir diferentes defectos del tubo neural a la desregulación específica de los mecanismos celulares que causan la falla del cierre del tejido, lo que podría cerrar la brecha entre los factores genéticos/ambientales y la biomecánica tisular y ayudar a prevenir la enfermedades.

Vale la pena señalar que, por definición, el módulo longitudinal de alta frecuencia medido por la técnica de Brillouin es diferente del módulo de Young de baja frecuencia o cuasi-estático medido por métodos convencionales como AFM. Sin embargo, para muchos materiales biológicos, se encuentra que los dos módulos cambian en la misma dirección en respuesta a las actividades biológicas48,49. Por lo tanto, con una calibración cuidadosa para materiales específicos, uno podría interpretar los datos de Brillouin en términos del módulo de Young. En este trabajo, usamos el cambio de Brillouin para estimar el cambio relativo del módulo del tejido asumiendo que la relación de densidad e índice de refracción (\(\rho /{n}^{2}\)) es constante. Para cuantificar directamente el módulo derivado de Brillouin, la microscopía de Brillouin se puede combinar con otras técnicas que pueden medir la densidad y/o el índice de refracción50. A medida que aumenta la profundidad de la imagen, la intensidad de la señal de Brillouin disminuirá según la transparencia del tejido. Para embriones de pollo, la profundidad máxima de penetración de nuestro instrumento es de unos 200 µm. Se puede lograr una mejora adicional mediante el uso de una fuente láser con una longitud de onda más larga o una técnica de corrección de frente de onda basada en óptica adaptativa51. El cambio de Brillouin inferior observado en el límite de la placa neural en las Figs. 2 y 3 es probablemente un artefacto del experimento. En la configuración confocal, el cambio de Brillouin en cada píxel es el promedio de todas las señales de Brillouin del punto de haz enfocado (vóxel). En el límite de la placa neural, dado que el punto del haz está parcialmente lleno de medio circundante y/o mesodermo que tiene un cambio de Brillouin más bajo, el efecto de promedio provocará una disminución del cambio de Brillouin final. Este efecto se puede mitigar mediante el uso de una lente de objetivo de NA alta junto con el posprocesamiento de datos35.

Se compraron huevos leghorn blancos fertilizados de la granja avícola de la Universidad de Connecticut. Para el cultivo in ovo, los huevos se incubaron a 37 °C con alta humedad. Las horas de incubación siguen a la estadificación de Hamburger-Hamilton (HH) (es decir, 26–29 h de incubación para obtener el embrión HH-4)52. Todos los experimentos llevados a cabo en este estudio se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, y los protocolos experimentales fueron aprobados por la oficina de Bioseguridad de la Universidad de Maryland. En este estudio no se utilizaron vertebrados vivos.

El protocolo de cultivo ex ovo se derivó de Chapman et al. y Schmitz et al.53,54 con modificaciones para adaptar al microscopio Brillouin. Se usó una placa con fondo de vidrio de 35 mm con un micropocillo de 20 mm (Cellvis, D35-20-0-N) para el cultivo ex ovo. Se cubrió un anillo metálico de 1 pulgada (Thorlabs, SM1RR) con Parafilm de una sola capa y se cortó un orificio elipse de 1 cm en el centro y se colocó sobre el micropocillo (pozo inferior interno del plato). Para realizar el cultivo ex ovo, utilizamos el método de soporte de papel de filtro para mantener el blastodermo y la membrana vitelina bajo tensión para imitar la situación del cultivo in ovo. El embrión precultivado alrededor de HH 4 se recogió del huevo y luego se colocó con el dorso hacia abajo en una placa de cultivo llena con albúmina delgada recolectada del huevo (medio de cultivo). A continuación, la placa se colocó en una incubadora en el escenario (Warner Instruments, SA-20PLIXR-AL) para un cultivo continuo. Para garantizar que la temperatura ambiente del embrión sea de aproximadamente 37 °C, el calentador (Warner Instruments, TC-344C) de la incubadora en estado encendido se ajustó a 39 ± 0,2 °C teniendo en cuenta la disipación de calor desde la parte inferior de la platina que es abierto a la lente del objetivo.

La dispersión de luz Brillouin espontánea es la interacción entre la luz incidente y los fonones acústicos inherentes dentro de una muestra. El resultado de esta interacción introduce un cambio de frecuencia (cambio de Brillouin) en la luz dispersada saliente. El desplazamiento de Brillouin \({\omega }_{B}\) se define como \({\omega }_{B}=2n/\lambda \cdot \sqrt{{M}^{^{\prime}}/ \rho }\cdot \mathrm{sin}(\theta /2)\), donde \(n\) es el índice de refracción del material, \(\lambda\) es la longitud de onda del láser, \({M}^{ ^{\prime}}\) es el módulo longitudinal que cuantifica las propiedades mecánicas, \(\rho\) es la densidad y θ es el ángulo de captación de la luz dispersada. En nuestro microscopio Brillouin, se recolectó la luz dispersada hacia atrás, produciendo \(\theta =180^\circ\).

Para los materiales biológicos, se ha establecido una relación empírica entre el módulo de Young \(E\) y el módulo longitudinal derivado de Brillouin \({M}^{^{\prime}}\): \(\mathrm{log}\left( {M}^{^{\prime}}\right)=a\cdot \mathrm{log}\left(E\right)+b\), donde los parámetros \(a\) y \(b\) son dependiente del material 24. Considerando la relación entre \({M}^{^{\prime}}\) y el desplazamiento de Brillouin \({\omega }_{B}\), el cambio relativo del desplazamiento de Brillouin está relacionado con el del módulo de Young por \ (\Delta E/E=2/a\cdot \Delta {\omega }_{B}/{\omega }_{B}\). Para las celdas, la calibración contra AFM muestra \(a=0.0671\). Aquí, usamos esta relación calibrada para estimar el cambio relativo del módulo de Young.

Se utilizó un microscopio confocal Brillouin para todos los experimentos. El detalle de la instrumentación se puede encontrar en nuestro reciente informe25. Brevemente, se utilizó como fuente de luz un láser de onda continua de 660 nm de modo único con una potencia de ~ 30 mW. El rayo láser se enfocó en la muestra mediante una lente objetivo (Olympus, 40 × /0,6 NA) instalada en un microscopio invertido (Olympus, IX81), que produce un tamaño de punto de 0,7 μm × 0,7 μm × 2,6 μm. La señal de Brillouin retrodispersada fue recolectada por el mismo objetivo y analizada por un espectrómetro basado en VIPA (Light Machinery, 15 GHz FSR) de dos etapas, y el espectro de Brillouin fue registrado por una cámara EMCCD (Andor, iXon 897) con un tiempo de exposición de 0,05 s. Las imágenes 2D de Brillouin se adquirieron escaneando la muestra utilizando una platina motorizada (tamaño de paso: 0,5 µm). La sección transversal perpendicular al eje anteroposterior del cuerpo se cartografió con un microscopio de Brillouin y se utilizó el desplazamiento de Brillouin promediado de la región de la placa neural para representar las propiedades mecánicas del tejido. El único contraste de una imagen de Brillouin proviene de la diferencia en el desplazamiento de píxeles de Brillouin. El cambio de Brillouin del medio de cultivo de albúmina delgada es muy similar al de la placa neural para embriones en etapa temprana, lo que dificulta la identificación del límite del tejido de la placa neural en la imagen de Brillouin. Para resolver este problema, justo antes de adquirir cada imagen de Brillouin, el embrión se transfirió temporalmente a una placa de cultivo diferente llena de solución de Ringer (Thermo Scientific, BR0052G) que tiene un cambio de Brillouin mucho menor y, por lo tanto, proporciona un buen contraste. Tan pronto como se realizó la medición de Brillouin, el embrión se volvió a transferir a un medio de cultivo de albúmina delgado para un desarrollo continuo. Para adquirir las imágenes de campo claro se utilizó un objetivo de bajo aumento (Olympus, 4x/0,1) y una cámara CMOS (Andor Neo) cuando el embrión estaba en la placa de cultivo ex ovo.

Se utilizó un programa de adquisición LabView (National Instruments, ver.2021) construido en casa para adquirir tanto imágenes de campo brillante como espectros de Brillouin. Para la calibración del espectrómetro, se registraron espectros de Brillouin de materiales (agua y metanol) con desplazamientos de Brillouin conocidos y se usaron para calcular el rango espectral libre y la relación de convención de píxel a frecuencia. El desplazamiento de Brillouin de cada píxel se obtuvo ajustando el espectro de Brillouin a una función lorentziana utilizando MATLAB (MathWorks, R2021b). Las imágenes 2D de Brillouin se reconstruyeron a partir del vector de píxeles. El tamaño de la muestra se eligió en base a la experiencia previa y razonablemente grande para demostrar la viabilidad de la técnica.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y sus archivos de información complementaria.

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Agradecemos a Eric Frank por asistir en el desarrollo del programa de adquisición de LabView. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver, los Institutos Nacionales de Salud (K25HD097288, R01HD095520) y la Fundación Nacional de Ciencias (DBI1942003).

Departamento de Bioingeniería de Fischell, Escuela de Ingeniería A. James Clark, Universidad de Maryland, College Park, MD, 20742, EE. UU.

Controlador checheno y Giuliano Scarcelli

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Estatal de Wayne, Detroit, MI, 48201, EE. UU.

jitao zhang

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JZ concibió el proyecto. CH, JZ y GS idearon el plan de investigación. CH realizó los experimentos. Todos los autores discutieron los datos. JZ y CH escribieron el manuscrito con aportes de todos los demás autores.

Correspondencia a Jitao Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Handler, C., Scarcelli, G. & Zhang, J. Imágenes mecánicas de lapso de tiempo del cierre del tubo neural en embriones vivos usando microscopía Brillouin. Informe científico 13, 263 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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Recibido: 13 Octubre 2022

Aceptado: 02 enero 2023

Publicado: 06 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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