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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3625 (2023) Citar este artículo

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La investigación basada en biochips está evolucionando actualmente hacia una base tridimensional y a gran escala similar al microambiente in vivo. Para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo y de alta resolución en estos especímenes, la microscopía no lineal capaz de obtener imágenes multiescala y sin etiquetas es cada vez más importante. La combinación con imágenes de contraste no destructivas será útil para ubicar de manera efectiva las regiones de interés (ROI) en muestras grandes y, en consecuencia, minimizar el fotodaño. En este estudio, una microscopía de coherencia óptica fototérmica (OCM) sin etiquetas sirve como un nuevo enfoque para ubicar el ROI deseado dentro de las muestras biológicas que están siendo investigadas por microscopía multifotónica (MPM). La perturbación fototérmica débil en la muestra por el láser MPM con potencia reducida se detectó en las partículas fototérmicas endógenas dentro del ROI utilizando el OCM fototérmico diferenciado de fase (PD-PT) altamente sensible. Al monitorear el cambio temporal de la señal de respuesta fototérmica del PD-PT OCM, el punto de acceso generado dentro de la muestra enfocada por el láser MPM se ubicó en el ROI. Combinado con el movimiento automatizado de la muestra en el eje x-y, el plano focal de MPM podría navegar de manera efectiva a la porción deseada de una muestra volumétrica para obtener imágenes MPM dirigidas de alta resolución. Demostramos la viabilidad del método propuesto en microscopía de segunda generación armónica utilizando dos muestras fantasma y una muestra biológica, un insecto fijo en portaobjetos de microscopio, con dimensiones de 4 mm de ancho, 4 mm de largo y 1 mm de espesor.

La microscopía multifotónica (MPM) permite realizar análisis de alta resolución en varios campos de investigación biológica. En los últimos años, el uso de MPM ha seguido ganando atractivo en imágenes biomédicas, especialmente en áreas de imágenes de neuronas profundas in vivo y en vivo en pequeños animales1,2,3,4,5, detección temprana de tumores y su caracterización6,7, 8,9, imagen de red vascular y organoides en su microambiente en bio-chips10,11,12. Ha habido muchos enfoques para aumentar la profundidad de la imagen, un mayor campo de visión (FOV) y acortar el tiempo de escaneo volumétrico mediante la adopción de fluoróforos apropiados13, óptica adaptativa14, mecanismos multihaz y multifocales15,16, además de otras modificaciones similares. en la configuración óptica que ha dado variaciones de los sistemas de imágenes MPM adoptables según las necesidades de imágenes y los escenarios de aplicación 5,16,17,18,19,20,21.

El fotodaño y el fotoblanqueo son factores críticos a tener en cuenta en las imágenes multifotónicas. La iluminación prolongada acompañada de la alta potencia del láser necesaria para obtener imágenes multifotónicas sin etiquetas genera un fotomecanismo de daño tisular que da como resultado una fluorescencia mejorada que provoca la muerte celular, lo que se conoce ampliamente como fotodaño 22,23,24. Para evitar la aparición de fotodaño en las células vivas, se debe tener cuidado para garantizar que los parámetros de imagen estén muy por debajo del umbral de fotodaño, como la intensidad máxima, la tasa de repetición y los tiempos de exposición prolongados (permanencia)24. La mayoría de estos parámetros pueden ser controlados por los sistemas de fuente y detección. Múltiples grupos de investigación estudiaron y propusieron varios enfoques para suprimir los efectos del fotoblanqueo y el fotodaño. El método más simple y más ampliamente adoptado es reducir la potencia de iluminación total de una fuente de luz4,25,26. Sin embargo, esto, a su vez, reduce la sensibilidad general del sistema debido a la reducción de la relación señal/ruido. Los enfoques alternativos informados para mitigar este efecto incluyen un método de exposición a la luz controlada que controla espacialmente la luz expuesta en la muestra, el uso de un divisor de pulso pasivo que redistribuye el pulso del láser de iluminación en subpulsos con energías iguales y un escaneo óptico rápido. mecanismo que reduce el fotodaño al controlar la iluminación y la recolección de emisiones de especímenes27,28,29,30. Además, utilizando el método de iluminación de lámina de luz, solo se ilumina efectivamente el plano focal del objetivo de detección31. Aunque estos métodos son útiles para reducir los efectos del fotodaño y el fotoblanqueo, se requiere iluminación de alta potencia a largo plazo cuando se busca una región de interés (ROI) en muestras grandes con FOV pequeños y largos tiempos de escaneo volumétrico, lo que resulta en fotodaño y fotoblanqueo.

En las últimas décadas, múltiples grupos de investigación reportaron las ventajas de incorporar MPM y tomografía de coherencia óptica (OCT) como una sola plataforma de imagen multimodal, donde sus ventajas compensan las limitaciones de las otras modalidades32,33,34,35. En particular, las técnicas de imagen MPM y OCT tienen diferentes características en términos de resolución, FOV, profundidad de imagen y velocidad de imagen. Por ejemplo, MPM utiliza un mecanismo no lineal que requiere un volumen muy enfocado del rayo láser en la muestra con un objetivo de apertura numérica (NA) alta que produce resoluciones laterales y axiales altas pero un FOV pequeño. Además, OCT es un sistema de imagen lineal que proporciona una mayor flexibilidad a la hora de elegir la resolución y el FOV que se adapte a su aplicación. En términos de profundidad de imagen, MPM normalmente proporciona profundidades de imagen de varios cientos de micrómetros en muestras biológicas donde existen una gran dispersión y aberraciones, mientras que OCT utiliza el mayor poder de penetración de las fuentes de luz infrarroja cercana para lograr profundidades de imagen de 1 a 2 mm en muestras biológicas. . La generación de imágenes volumétricas de muestras utilizando un sistema MPM requiere el uso de una etapa de eje z con escaneo bidimensional en la dirección transversal para mover la muestra axialmente. Por el contrario, la OCT puede adquirir imágenes volumétricas utilizando solo barridos ráster x–y sin mover la muestra axialmente. El sistema MPM-OCT combinado puede servir como una plataforma eficaz de imágenes multiescala para investigaciones biológicas mediante el uso complementario de la superioridad de cada sistema en imágenes.

Desde la introducción de OCT, varios grupos de investigación investigaron y utilizaron las diferentes propiedades funcionales de la fuente láser y el mecanismo de detección para establecer nuevos métodos con respecto a los requisitos de imagen. Varios ejemplos incluyen Doppler OCT para mediciones de flujo en muestras36, OCT sensible a la polarización para estudiar las propiedades de birrefringencia en la muestra37,38, elastografía de coherencia óptica para medir el estrés y la resistencia a la tracción de las estructuras dentro de las muestras37,38, OCT espectroscópica para investigar la dependencia de la longitud de onda. absorción y dispersión de luz de estructuras en muestras37,38 y OCT fototérmico (PT-OCT) para analizar fluctuaciones térmicas dentro de muestras39,40,41. Entre estas tecnologías, PT-OCT ha atraído una importante atención de investigación para la evaluación de las fluctuaciones térmicas de las muestras y los cambios resultantes en sus propiedades físicas y ópticas. En los sistemas PT-OCT, se han utilizado nanopartículas, agentes de contraste exógenos sensibles a la fototermia y absorbentes para generar y medir los efectos fototérmicos dentro de la muestra42,43,44,45. Hasta la fecha, los estudios que utilizan agentes de contraste endógenos en lugar de agentes de contraste externos se han visto limitados debido a la falta de utilidad y la dificultad para medir señales de respuesta fototérmica débiles. Milner et al. propusieron una medición de fase diferencial para la detección resuelta en profundidad de la respuesta fototérmica en el tejido, sin el uso de contraste externo o material absorbente46,47. Aunque la técnica de detección de respuesta fototérmica propuesta se puede aplicar a muestras sin necesidad de contraste o absorbentes, requiere múltiples canales de detección dedicados y un retardo óptico de escaneo rápido para igualar las dos rutas interferométricas diferentes en el escaneo de muestra introducido por el material birrefringente. Además, la potencia del láser de iluminación necesaria suele ser de 80 a 100 mW para muestras biológicas, a fin de medir la respuesta fototérmica con una relación señal/ruido razonable47. Los avances recientes en las técnicas de PT-OCT han permitido mediciones de respuesta fototérmica efectivas utilizando contraste endógeno utilizando un solo canal de detección y con una potencia de iluminación láser reducida de 4 a 10 mW39,48,49,50.

Este estudio sirve como precursor de la dirección de un nuevo mecanismo de ubicación de ROI a lo largo de tres ejes dentro del volumen de la muestra para reducir los efectos generales del fotodaño y el fotoblanqueo y mejorar la comodidad del usuario en la obtención de imágenes multifotónicas de muestras volumétricas. Los ROI deseados se seleccionaron dentro de la profundidad observable completa y el rango lateral de Microscopía de coherencia óptica (OCM). Los cambios en las propiedades ópticas de la muestra debido a los efectos fototérmicos iluminados por la fuente láser MPM se midieron en las partículas fototérmicas endógenas dentro del ROI utilizando el OCM fototérmico diferenciado de fase (PD-PT) altamente sensible. Al monitorear el cambio temporal de la señal de respuesta fototérmica del PD-PT OCM, la posición de enfoque del láser de excitación (punto de acceso) se colocó en el ROI. Combinado con el movimiento automatizado de la muestra en el eje x-y, el plano focal de MPM podría navegar de manera efectiva a la porción deseada de una muestra volumétrica para obtener imágenes MPM dirigidas de alta resolución. La navegación ROI se logró utilizando una fuente láser MPM de baja potencia (inferior a la potencia convencional por un factor de menos de 10). El método de guía PD-PT OCM se puede implementar para cualquier técnica de imagen no lineal que requiera iluminación láser de alta potencia, lo que provoca fotoblanqueamiento y fotodaño en las muestras, por ejemplo, fluorescencia excitada de dos fotones y microscopía de dispersión anti-Stokes Raman coherente.

Cuando un rayo láser de alta energía irradia una muestra, la temperatura interna y las propiedades ópticas de la estructura interna de la muestra cambian51. En la técnica de formación de imágenes OCT, la señal de interferencia detectada en el OCT de dominio de Fourier se puede expresar como Eq. (1) en forma compleja:

donde z es la diferencia de longitud de camino entre el espejo de referencia y la interfaz dentro de la muestra. \({I}_{R}\) y \({I}_{S}\) son las intensidades de luz reflejadas desde el espejo de referencia y la interfaz de muestra, respectivamente. \(\Phi \left(z,t\right)\) es el término de fase de la señal de interferencia, que se puede representar como una función integral del índice de refracción dependiente de la profundidad en el espacio en un cierto punto en el tiempo, como expresado por la Ec. (2):

donde ω es la frecuencia angular central de la fuente de luz y c es la velocidad de la luz en el vacío. Se supone que la muestra está ubicada en el lado positivo en el dominio del espacio, y \(n\left(z,t\right)\) representa la profundidad y el índice de refracción dependiente del tiempo dentro de la muestra. Cuando ocurre un cambio de temperatura dentro de la muestra, la respuesta térmica observada ópticamente en la muestra es un cambio de fase debido a los efectos termoelásticos y termorrefractivos. Por lo tanto, la ecuación. (2) puede extenderse considerando las respuestas térmicas, expresadas por la ecuación. (3) (Ref.47).

donde dn/dT representa el cambio en el índice de refracción con la temperatura, \(\Delta T\left(z,t\right)\) representa el cambio de temperatura en los tejidos de muestra, y \(\beta\) es la expansión térmica coeficiente47. Para medir los cambios de fase en la muestra debido a la respuesta térmica cuando se ilumina con la fuente láser MPM, se obtuvieron señales de interferencia complejas como valores digitalizados con PD-PT OCM. El término de fase obtenido es la fase acumulada a lo largo de la profundidad. Por lo tanto, primero requiere diferenciación para resolver la fase acumulada46,47,49, como lo expresa la Ec. (4).

donde \(m\) es el índice de profundidad de los escaneos A, y \(n\) denota los índices incrementales secuenciales designados desde la primera hasta la última señal del escaneo A con intervalo de tiempo \(\Delta t\). Se obtuvo el número total N de escaneos A para la misma posición lateral en la muestra para aumentar la sensibilidad de la respuesta térmica. Toma un período de tiempo de T que es igual a \(\left(N-1\right)\) veces el intervalo \(\Delta t\). El N de A-scans se denomina marco. Los escaneos A sucesivos se restan para medir el cambio de fase a lo largo del tiempo, como se expresa en la ecuación. (5).

donde \(\varphi (m,n)\) es el ruido de fase aleatorio generado en el sistema dentro del intervalo de tiempo \(\Delta t\) para el índice espacial × m y el índice temporal n. En este estudio, se obtuvieron 801 escaneos A durante el período de tiempo para lograr 800 escaneos A diferenciados. Las fases diferenciadas más allá del rango de −π y π se envolvieron con −2π para evitar posibles errores cerca de los límites –π y π. Se seleccionó una profundidad específica \(d\) de interés entre las profundidades de los escaneos A y se lograron 800 valores de fase diferencial en la profundidad. d corresponde al producto de \({m}_{s}\) y \(\Delta z\), donde \({m}_{s}\) es el índice de profundidad seleccionado y \(\Delta z\ ) es el intervalo de profundidad. Promediamos esos valores de fase diferencial en una diferencia de fase efectiva que ocurrió dentro del período de tiempo para suprimir errores de fase aleatorios, mejorando así la sensibilidad de detección de respuesta térmica del sistema. El ruido de fase resulta principalmente de cambios térmicos ambientales y vibraciones mecánicas en el sistema. Luego se calculó la fase diferencial promediada \({\Delta \Phi }_{avg}(d)\) usando la ecuación. (6).

donde \(\Delta ={\Delta }_{t}{\Delta }_{z}\) y \(\Delta \Phi ({m}_{s},n)\) indican los valores de fase diferencial en una profundidad específica d en la \({n}\)ésima señal de exploración A diferenciada, respectivamente. Este proceso se repitió secuencialmente el número deseado de veces \(Fn\) (número de cuadro). Aquí, el término marco no debe confundirse con la denotación convencional para B-scan, que generalmente se usa en imágenes OCT. \(Fn\) son los 801 escaneos A acumulados desde un solo punto. El término "marco" se usa aquí para que los lectores contemplen y correlacionen el sentido del tiempo que lleva tener una señal PD-PT-OCM cuando se puede relacionar con un B-scan para comprender la capacidad de medición de alta velocidad del método propuesto. Para perturbar la respuesta fototérmica en la muestra y generar el cambio de fase resultante con la fuente láser MPM, se incorporó un obturador mecánico en la trayectoria del haz de iluminación MPM y luego se controló de forma remota para abrir y cerrar en momentos específicos dentro de la duración de \( Fn\), según el requisito. A lo largo de este estudio, el valor máximo utilizado para \(Fn\) fue 50 a menos que se indique lo contrario. La medida de 50 fotogramas se denomina lectura de la respuesta fototérmica a la perturbación y corresponde a un ciclo de iluminación. El obturador se configuró para abrirse y cerrarse cerca del centro de cada ciclo de iluminación. Esto fue para asegurar que hubiera suficiente tiempo para que la muestra se enfriara a su temperatura natural. La implementación de la acción del obturador para una sola lectura de la respuesta fototérmica y el cambio de fase típico a lo largo del tiempo se muestra en la Fig. 1.

Relación entre el número de cuadro, la acción del obturador y la respuesta fototérmica durante un ciclo de iluminación.

Los agentes de absorción endógenos ópticos, como los lípidos, el agua, la melanina y la hemoglobina, etc., están ampliamente presentes en los tejidos biológicos52. Después de seleccionar un ROI dentro de la imagen OCM volumétrica, se seleccionó un agente de absorción dentro del ROI que mostró una respuesta fototérmica apropiada como punto de observación para la respuesta fototérmica. Cuanto más cerca esté la posición focal de la luz de excitación del MPM al punto de observación, mayor será la respuesta fototérmica. Medimos múltiples respuestas fototérmicas mientras variamos la distancia entre el punto de observación y la posición focal del haz de iluminación, para determinar el punto en el que se maximizó la respuesta fototérmica. Cabe señalar que el plano focal de la luz de excitación de MPM se colocó en el ROI, y la imagen de MPM se pudo obtener inmediatamente sin deambular para encontrar el ROI. En la Fig. 2 se muestra una representación esquemática del flujo de trabajo general antes mencionado. En combinación con el movimiento automatizado de la muestra en el eje x–y, la búsqueda de localización de profundidad del ROI se ha ampliado para explorarse en tres dimensiones.

Flujo de trabajo para la detección de respuesta fototérmica con el OCM PD-PT sin etiquetas. Descripción figurativa paso a paso del proceso de cálculo de la señal fototérmica mediante el OCM PD-PT.

Se fabricaron y usaron dos muestras fantasma diferentes en este estudio experimental para demostrar y caracterizar el MPM guiado por OCM PD-PT propuesto. El primero fue una muestra fantasma simple utilizada para evaluar el concepto y analizar la señal fototérmica detectada. Se utilizó una muestra fantasma adicional con una estructura multicapa para validar la solidez de la aplicabilidad del sistema propuesto a una muestra compleja como la red de vasos sanguíneos de estructuras tisulares. Finalmente, lo aplicamos a una muestra de insecto (Ixodes dammini) con dimensiones de 4 × 4 × 1 mm, incrustada en un portaobjetos de microscopio, para evaluar la aplicabilidad práctica del sistema para muestras biológicas. La información detallada sobre las muestras utilizadas se proporciona en la sección "Materiales y métodos".

Se utilizó una muestra fantasma simple (gel de ultrasonido) para caracterizar y analizar la respuesta fototérmica utilizando el método propuesto. El protocolo experimental fue similar para todos los experimentos realizados en este estudio (consulte la sección "Materiales y métodos" para la fabricación de muestras fantasma de red simple y compleja y el protocolo experimental). La respuesta fototérmica se midió como se muestra en la Fig. 3. Las partículas de retrodispersión, como burbujas de aire o polvo, ubicadas en la región media del medio de gel, se seleccionaron en la imagen OCM transversal como un punto de observación para la respuesta fototérmica. La posición focal del objetivo MPM se movió hacia arriba a lo largo del eje óptico del OCM, desde debajo del cubreobjetos y a través del área del gel ultrasónico de la muestra fantasma, como se muestra en la Fig. 3a. La respuesta fototérmica se midió para cada movimiento de 10 µm del objetivo MPM hasta 500 µm de la distancia total de recorrido correspondiente a 50 lecturas. El tiempo total requerido para 51 lecturas fue ~ 73 s. No se incluyó el tiempo dedicado a trasladar las traducciones manuales. Como se muestra en la Fig. 3b, la señal de respuesta fototérmica a intervalos de 100 µm de las lecturas totales se indica mediante el área del cuadro rectangular punteado. Se puede ver que la respuesta fototérmica máxima detectada en cada lectura exhibió un aumento y una disminución constantes a medida que la posición de enfoque del objetivo del MPM se acercaba y se alejaba de la región media de la muestra, respectivamente. Como era de esperar, la respuesta fototérmica se maximizó cuando pasó por la región media del gel. Las figuras 3c, d son los gráficos ampliados que se muestran en la figura 3b, que indican las señales de respuesta fototérmica observadas cuando el punto focal del objetivo MPM estaba cerca de la mitad de la región del gel y las características detalladas de la respuesta fototérmica, respectivamente. Como se puede ver a lo largo de la Fig. 3b-d, la respuesta fototérmica detectada en todas las lecturas exhibió dos picos que representan el cambio de diferencia de fase correspondiente a la perturbación de temperatura máxima. La temperatura de la muestra cambió más rápidamente justo después de abrir y cerrar el obturador. Cuando el obturador estaba abierto, el rayo láser MPM se enfocaba en la muestra, induciendo así efectos fototérmicos debido a los cambios en la temperatura interna de la muestra, que se consideró como la primera región de perturbación de temperatura (aumento de temperatura), como se muestra en la Fig. 3c. Cuando la temperatura alcanzó su máximo y se estabilizó, el cambio en la diferencia de fase volvió a un valor cercano al de la temperatura de referencia en ausencia de iluminación. Cuando se cerró el obturador, la energía térmica acumulada en la muestra comenzó a disminuir. En otras palabras, cuando la causa del aumento de temperatura (rayo láser MPM) ya no está expuesta a la muestra, la temperatura general de la muestra disminuye y se estabiliza a su temperatura natural inicial. Esto puede verse como la segunda región de perturbación de la temperatura (disminución de la temperatura), como se muestra en la Fig. 3d.

Análisis de señal OCM PD-PT utilizando una muestra fantasma simple. (a) es la descripción figurativa del movimiento de la posición del foco del MPM sobre una profundidad variada. (b) es la respuesta fototérmica completa observada en la muestra fantasma simple dentro de un rango de profundidad de 500 µm. (c) es el gráfico ampliado de la respuesta fototérmica observada en la región media de la muestra. (d) es la respuesta fototérmica máxima observable dentro de la muestra. (e) son los valores medios máximos de fase trazados contra el rango de profundidad de 500 µm en la muestra. (f) es el gráfico trazado a partir de la diferencia absoluta entre valores sucesivos en (b). La figura (a) no está dibujada a escala.

Para analizar más a fondo la cantidad de respuesta fototérmica según el cambio de la posición focal de la lente del objetivo, los valores máximos en las señales fototérmicas se trazan con respecto a las diferentes posiciones focales del objetivo MPM en profundidad, como se muestra en la Fig. 3e. Esto permite la visualización de la respuesta térmica general de la muestra. La línea discontinua roja en la Fig. 3e indica el punto de observación seleccionado del OCM para la respuesta fototérmica, dado que el objetivo del MPM se trasladó a lo largo de la profundidad de la muestra. Los tres picos de intensidad (negro) son las señales SHG detectadas correspondientes a la primera superficie del cubreobjetos, la segunda superficie del cubreobjetos y la primera superficie del portaobjetos de vidrio, respectivamente. El punto de observación de la respuesta fototérmica coincide con la mitad del área del gel entre las dos señales SHG que representan la segunda superficie del cubreobjetos y la primera superficie del portaobjetos de vidrio. Al aplicar un ajuste polinomial de quinto orden (para compensar el ruido de fase aleatorio inducido) a la curva de la señal fototérmica, se obtuvo una tendencia de transición suave de la curva. Además, en la Fig. 3f se muestra un gráfico que representa la diferencia absoluta entre valores sucesivos después del ajuste polinomial. Esto permite la visualización clara de la instancia en la que el foco del objetivo MPM coincidió con el punto de observación fijo.

Para evaluar la selección de ROI para imágenes no lineales utilizando PD-PT OCM, en el experimento se utilizaron muestras fantasmas compuestas multicapa de gran área que imitan la estructura del tejido de los vasos sanguíneos o las redes neuronales. La muestra contenía un tejido de limpieza de lentes multicapa con un grosor de aproximadamente ~ 300 µm que se sumergió en agua destilada (consulte la sección "Materiales y métodos" para obtener más detalles). Se utiliza para validar la eficacia del método de selección de ROI utilizando las capacidades de imágenes transversales y frontales en tiempo real de OCM, que tiene un FOV más amplio que el FOV limitado de MPM. Esto se muestra en la Fig. 4a-c,e,f. La Figura 4a presenta la imagen OCM volumétrica tridimensional (3D) de la muestra con un FOV de 3,0 × 3,5 × 0,3 mm a lo largo de los ejes horizontal, vertical y de profundidad. La imagen de volumen 3D está resaltada por dos regiones de ROI rectangulares: el ROI inicial (naranja) y el ROI movido (azul) en las ubicaciones deseadas para las imágenes de MPM. La Figura 4b, e presenta las imágenes OCM en face con un FOV de 1,0 × 1,5 mm obtenidas en las regiones ROI. La figura 4c,f presenta imágenes ampliadas de las ROI que se muestran dentro de las áreas rectangulares de cuadro azul y amarillo en la figura 4b,e, respectivamente, que se usaron para comparar con las imágenes SHG. El primer punto de observación dentro del ROI inicial se seleccionó a una profundidad de 100 μm, donde estaba cerca del cubreobjetos. El plano focal del objetivo MPM se posicionó utilizando el mecanismo de selección de ROI. Las Figuras 4e-g se obtuvieron después de mover la muestra a 1000 μm en las direcciones laterales de X e Y, respectivamente, y 100 μm en la dirección de profundidad hacia el portaobjetos de vidrio (eje Z); para simular la navegación de diferentes ROI (consulte la sección "Materiales y métodos" para obtener más detalles). Antes del movimiento de la muestra, la región seleccionada de la estructura del tejido para obtener imágenes de MPM estaba cerca del cubreobjetos; y después del movimiento de la muestra, la región de las estructuras de tejido de las que se van a obtener imágenes se reubicó más cerca de la primera superficie del portaobjetos de vidrio. La Figura 4d, g presenta las imágenes MPM SHG obtenidas antes y después del movimiento de la etapa de muestra. Las imágenes SHG eran imágenes apiladas con un rango de profundidad de 70 µm dentro de los cuadros rectangulares naranja y azul representados en la imagen volumétrica OCM, y esto se hace para hacer coincidir y correlacionar mejor las imágenes frontales MPM con las imágenes frontales OCM. Las cruces huecas en las regiones roja, naranja y azul indicaron correlaciones con posiciones coincidentes en las respectivas imágenes frontales OCM y MPM.

Evaluación de la solidez del MPM guiado por OCM de PD-PT con una muestra fantasma de red compleja. (a) es la imagen OCM volumétrica 3D de la muestra. (b, c, e, f) son imágenes frontales OCM de la muestra fantasma de red compleja. (c, f) son las regiones ampliadas indicadas por cuadrados discontinuos en (b) y (e), respectivamente. (d, g) son las imágenes frontales SHG apiladas de la misma ubicación escaneadas en (c) y (f). Además, en (a), los cuadros rectangulares en naranja y azul indican el rango de profundidad de apilamiento para las imágenes SHG en las ROI iniciales y movidas en las ubicaciones deseadas, respectivamente.

Para validar la utilidad de la orientación de PD-PT OCM para ROI en una muestra biológica de gran volumen para imágenes de MPM, se utilizó una muestra biológica (Ixodes dammini hembra) incrustada en un portaobjetos de microscopio. Antes de la obtención de imágenes fototérmicas, se tomaron imágenes de la muestra con el FOV máximo del OCM y se posprocesaron utilizando un software de representación de volumen. En la Fig. 5a se muestra una imagen 3D de OCM renderizada en volumen, y en la Fig. 5b se muestra una imagen frontal de la imagen de volumen a una profundidad de 65 µm. Mediante el uso de imágenes OCM transversales y frontales en tiempo real, se seleccionaron múltiples secciones diferentes de la muestra biológica utilizando el mecanismo de selección de ROI basado en la medición de la respuesta fototérmica con el OCM PD-PT. Se utiliza un área total de 4 × 4 mm (vertical × horizontal) para la selección de ROI. En particular, se seleccionaron y apuntaron cuatro regiones, que se ubicaron en la superficie superior del escudo/escudo, borde superior del palpo izquierdo, punta del hipostoma y borde superior del palpo derecho. Entre estas partes, se eligieron el hipostoma, los bordes izquierdo y derecho de los palpos, ya que estas partes de las garrapatas son más útiles en los estudios de los hábitats de alimentación de las garrapatas relacionados con la enfermedad de Lyme53, y el escudo cubre la porción superior de la superficie dorsal. Casi todas las partes del cuerpo del espécimen ofrecieron una buena señal PD-PT-OCM observable, y cabe destacar que la respuesta de la señal fototérmica se reduce con un mayor espesor. Esto puede deberse a la composición y las propiedades ópticas y térmicas de la muestra. Las imágenes SHG de las regiones objetivo se muestran en la Fig. 5c-f, respectivamente. Las lecturas totales de las respuestas fototérmicas observadas en la región del hipostoma de acuerdo con las posiciones focales del objetivo MPM que varían en profundidad se muestran en el gráfico trazado en la Fig. 5g. El intervalo de paso entre dos posiciones de profundidad que se utiliza aquí es de 20 µm. Se utilizaron un total de 11 lecturas para cubrir toda la región del hipostoma. Como se puede ver en el gráfico de una respuesta fototérmica representativa, como se muestra en la Fig. 5h, los picos máximos diferenciados por fase detectados no fueron inversamente proporcionales. Esto se puede atribuir a la expansión termoelástica de las estructuras biológicas de la muestra.

Verificación de la aplicabilidad del MPM guiado por OCM PD-PT propuesto para una muestra biológica. (a, b) son la imagen renderizada en volumen OCM respectiva y la imagen frontal de la muestra de insectos. Las figuras (c a f) son imágenes frontales de MPM de diferentes regiones de la muestra obtenidas utilizando la guía PD-PT OCM. ( g ) es la respuesta fototérmica representativa observada al variar la posición de profundidad del objetivo MPM en la región del hipostoma de la muestra, y ( h ) es el gráfico representativo de una señal de respuesta fototérmica PD-PT OCM.

El uso de MPM ha ganado progresivamente popularidad en diversos escenarios de imágenes biomédicas. Uno de esos aspectos en los que MPM ha crecido en aplicabilidad son las investigaciones de investigación basadas en biochips. La investigación basada en biochips está evolucionando actualmente desde plataformas bidimensionales (2D) a 3D, similares al microambiente in vivo. En particular, es necesario establecer una complejidad biológica a gran escala para crear órganos artificiales para futuras pruebas de detección de drogas o eventuales reemplazos de órganos. Para lograrlo, actualmente se está investigando sobre la impresión 3D y métodos de autoorganización basados en organoides54,55. Para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo y el análisis multiescala de especímenes a gran escala, la microscopía no lineal capaz de obtener imágenes de tejidos profundos y sin etiquetas es cada vez más importante56,57. Al realizar microscopía no lineal, se debe tener cuidado para evitar el fotodaño. El método propuesto utiliza partículas endógenas dentro de la muestra para la ubicación de la ROI en 3D en imágenes multifotónicas sin etiquetas. El método propuesto puede minimizar el fotodaño al identificar con precisión un ROI, donde se requieren imágenes moleculares 3D de alta resolución (información complementaria). Este concepto es similar al de la microscopía de contraste de fase, que se usa comúnmente en los microscopios de fluorescencia para minimizar el fotoblanqueo, pero este mecanismo de guía convencional ofrece solo una imagen topológica 2D de la muestra. La OCT se puede utilizar como una modalidad para obtener imágenes guiadas de tejidos biológicos gruesos, no transparentes y a gran escala en 3D, al igual que la microscopía de contraste de fase, que se utiliza como una herramienta de imágenes de guía para muestras transparentes.

En el estudio actual, obtuvimos la curva de respuesta fototérmica mientras cambiamos manualmente el punto focal del objetivo MPM que se mueve hacia el punto de observación (objetivo OCM). La curva de respuesta fototérmica tiene la forma de una función unimodal con un valor máximo en el área de medición. En el futuro, mediante la incorporación de un método de búsqueda eficiente bien establecido, como la búsqueda de la sección áurea58, la búsqueda de Fibonacci59 o la búsqueda de ajuste de curvas60 (con un motor de enfoque axial automatizado incorporado con la lente del objetivo) en lugar de una búsqueda lineal de 50 intentos a intervalos de 10 µm; el punto deseado se puede encontrar con la misma precisión en menos de 10 intentos. Además, el tiempo de búsqueda se puede reducir significativamente cuando el algoritmo de búsqueda de alta velocidad se combina con un dispositivo motorizado de alta velocidad para la exploración axial del plano focal del objetivo MPM. En este estudio, se utilizó la ubicación de ROI en una muestra biológica relativamente grande con dimensiones de 4 × 4 mm (vertical × horizontal), un total de 11 lecturas con un intervalo de paso de 20 µm en dirección de profundidad. El intervalo de paso y las lecturas totales se pueden elegir de forma adaptativa según la composición y el grosor de la muestra.

La probabilidad de que se produzca un error en la ubicación de la ROI (en profundidad) para la guía del objetivo MPM depende de la resolución axial del sistema OCM y de la sensibilidad de fase. La resolución axial del sistema OCM utilizado es de ~ 5 µm. Por lo tanto, la precisión de la guía del objetivo MPM es la misma que la resolución axial del OCM. El sistema de imagen multimodal propuesto está configurado de manera que el OCM y el MPM estén alineados coaxialmente y en lados opuestos de la muestra. El método demostrado mide la posición absoluta del punto de acceso del objetivo MPM dentro de la muestra, por lo tanto, incluso si se utiliza una muestra con estructuras complejas e interfaces de muestra, el rendimiento de la detección PD-PT-OCM no está sujeto a mediciones erróneas. El FOV del sistema PD-PT-OCM se puede cambiar de forma adaptativa según los requisitos de imagen cambiando las lentes del objetivo en la configuración del brazo de muestra y de referencia. Sin embargo, el FOV y la resolución lateral están inversamente relacionados. En general, los objetivos FOV más amplios tendrán una resolución lateral más baja y viceversa. La capacidad de obtención de imágenes resueltas en profundidad de OCM se reduce en muestras gruesas. Esto se debe a las limitaciones de penetración de la luz en los tejidos gruesos. Además, en muestras gruesas con estructuras complejas densamente empaquetadas, las señales generadas multifotónicas detectables se reducen en los tejidos más profundos. Por lo tanto, el calor generado por el punto de acceso de MPM también se degradará en los tejidos más profundos. La usabilidad de los métodos propuestos para la selección de ROI utilizando OCM no solo se limita con el grosor de la muestra fantasma que se informa aquí. La selección de ROI dentro de la muestra es posible a lo largo de todo el rango de profundidad óptica de OCM y solo depende de la composición de la muestra y la óptica utilizada para el sistema OCM. La señal fototérmica generada dentro de la muestra se puede detectar de manera efectiva a lo largo de todo el rango de profundidad observable del PD-PT-OCM. La disipación de la señal fototérmica y la degradación de la eficiencia de detección dependerán del espesor de la muestra, la composición y sus propiedades ópticas y térmicas51.

Convencionalmente, las imágenes OCT fototérmicas se utilizan para obtener imágenes de los vasos sanguíneos utilizando el efecto fototérmico de las células sanguíneas, que son sustancias endógenas, o para medir la ubicación y los puntos calientes de partículas fotorreactivas exógenas, como polímeros y nanovarillas de oro en tejidos vivos. El OCM PD-PT de alta sensibilidad también se puede utilizar si hay factores endógenos o exógenos presentes dentro del rango observable de la imagen OCM. Usando el método propuesto, podemos orientar cuidadosamente la iluminación de excitación para la terapia fototérmica con sustancias exógenas y restringirla localmente a la ubicación deseada, evitando así el calentamiento innecesario de los tejidos normales.

En resumen, este documento sirve como un informe preliminar para presentar la usabilidad potencial de emplear PD-PT OCM como una herramienta de guía para la microscopía no lineal para navegar de manera efectiva y precisa por los ROI en muestras de gran volumen. Las regiones de interés se seleccionaron utilizando el FOV grande y el rango de profundidad observable en imágenes OCM transversales y de frente. Para lograr imágenes de MPM dirigidas dentro de los ROI en 3D, se detectaron puntos de acceso dentro de la muestra enfocada con el láser de MPM a una potencia débil utilizando el OCM PD-PT de alta sensibilidad. Luego enfocamos el láser MPM en un punto de observación seleccionado de los agentes de absorción endógenos en el ROI. El OCM PD-PT permite colocar la posición focal del objetivo MPM en el ROI dentro del rango de profundidad observable de la imagen transversal OCM. Encontrar y enfocarse de manera efectiva en las ROI que requieren imágenes MPM de alta resolución puede reducir el tiempo de exposición general de los láseres de alta potencia, especialmente para muestras grandes, mitigando significativamente el fotoblanqueo y el fotodaño. El sistema PD-PT OCM de alta sensibilidad tiene aplicaciones potenciales para el análisis de reacciones fototérmicas porque puede detectar en tiempo real incluso cambios de temperatura debido a una débil perturbación fototérmica que ocurre dentro de muestras biológicas tridimensionales. Además, cabe señalar que la utilidad del método de guía basado en OCM PD-PT propuesto se puede implementar para cualquier técnica de imagen no lineal que requiera iluminación láser de alta potencia (que puede provocar fotoblanqueo y fotodaño en las muestras), como dos -fluorescencia excitada por fotones y microscopía de dispersión anti-Stokes Raman coherente. Esto reduce el tiempo total de adquisición requerido para la ubicación de la ROI en sistemas de imágenes no lineales.

La configuración general del sistema de imágenes multimodales se ilustra en la Fig. 6. La plataforma de imágenes multimodales tenía dos fuentes de luz independientes. El sistema OCM estaba alimentado por una fuente de luz de banda ancha superluminiscente (SLD-37-HP3, Superlum Diodes Ltd., Carrigtwohill, Irlanda) con una potencia de salida máxima de 18 mW centrada en 840 nm. La salida de la fuente se conectó directamente al puerto de entrada de un circulador óptico (850-H7-L-15-FA, OF-LINK Communications Co., Ltd. Shenzhen China). El puerto de salida del circulador se conectó a un colimador doblete (F240APC-850, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) con un tamaño de haz de 2,4 mm. El haz colimado se rasterizó a lo largo de los ejes horizontal y vertical utilizando un espejo de exploración de galvanómetro de doble eje (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.). Posteriormente, el haz de exploración se dirigió hacia una combinación de lentes de exploración y tubo con distancias focales de 54 mm (LSM04-BB, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) y 200 mm (TTL200-B, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) UU.), respectivamente. Con esta configuración, el tamaño del haz óptico (del colimador) se magnificó por un factor de 3,7. Luego, el haz ampliado se dividió mediante un divisor de haz rectangular (BSW11, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) en una proporción de 50:50. Los haces divididos se dirigieron al brazo de referencia y la configuración del brazo de muestra. El haz hacia la ruta de referencia pasó a través de una combinación de sistemas ópticos como un atenuador variable continuo (NDC-50C-4 M, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) y una lente objetivo de 4 × (UPlanFL N 4.0x, Olympus, Tokio, Japón) con una distancia focal de 45 mm, seguido de un espejo de banda ancha altamente reflectante (PF10-03-P01P, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.). De manera similar, en la ruta de la muestra, el haz dividido incidente se dirigió a una lente objetivo que coincidía con las especificaciones de la lente objetivo utilizada en la ruta de referencia. El rayo láser retrorreflejado de la superficie de la muestra interfirió con el rayo de referencia retrorreflejado en el divisor de haz. La señal de interferencia retrodispersada se dirigió a través de un circulador a un espectrómetro que contenía una cámara de exploración lineal (Sprint spl4096-140k, Basler AG, Ahrensburg, Alemania) con 4096 píxeles. En la configuración actual, el espectro cubría solo la parte media del sensor de la cámara y solo se usaron 2048 píxeles en la cámara de exploración lineal. Las señales detectadas se procesaron en una computadora para mostrar las imágenes OCM transversales y frontales en tiempo real. El sistema OCM construido tenía resoluciones axiales y laterales de ~ 5 µm y un FOV máximo de 4 × 4 × 1 mm a lo largo de los ejes horizontal, vertical y de profundidad, respectivamente. Se escaneó sucesivamente un conjunto de 250 posiciones laterales (línea A) para construir una imagen OCM de sección transversal 2D, y se escanearon 250 posiciones horizontales (imágenes 2D) para obtener un conjunto de imágenes de volumen. Se seleccionó una profundidad específica del conjunto de imágenes de volumen (según se requería) para obtener una imagen frontal en tiempo real. El sistema OCM tenía una velocidad promedio de 90 cuadros por segundo.

Esquema del sistema de imagen multimodal. Esquema de diseño óptico con los componentes ópticos utilizados junto con las fuentes de MPM y OCM, los componentes de detección y la etapa de muestra traslacional micrométrica de dos ejes. Figura no dibujada a escala.

El sistema MPM tenía una fuente de láser de fibra de femtosegundos de alta potencia (ELMO HP, Menlo Systems, Inc., NJ, EE. UU.) con una potencia de salida máxima de 180 mW y un ancho de pulso de < 70 fs (típicamente 45 fs), y una frecuencia de repetición de 100 MHz. La fuente láser se centró en 1560 nm, con un ancho de banda espectral de 30 nm. El rayo láser se colimó usando un colimador de triplete óptico (TC18APC-1550, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) con un tamaño de rayo de aproximadamente ~ 3 mm. La potencia del láser se controló según se requería usando una combinación de atenuadores ópticos. El haz de propagación luego pasó a través de un obturador mecánico controlado electrónicamente (SHB025, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.). La computadora controló el obturador mecánico para obtener iluminación óptica en la región de la muestra durante un tiempo de operación específico, según se requiera. El rayo láser subsiguiente después del obturador se rasterizó a lo largo de los ejes horizontal y vertical utilizando un espejo de exploración de galvanómetro de doble eje (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.). Luego, el rayo láser pasó a través de una combinación de lentes de escaneo (SL50-2P2, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) y lentes de tubo (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) con distancias focales de 50 mm y 200 mm. , respectivamente. Esta combinación óptica magnificó el rayo láser por un factor de 4. El rayo láser colimado y magnificado se propagó a través de un espejo dicroico (FF801-Di02-25 × 36, IDEX Health & Science, LLC, Nueva York, EE. UU.). El espejo dicroico se colocó con un ángulo de inclinación de 45° con respecto al haz láser incidente. Luego, el rayo láser MPM redirigido se enfocó en la muestra utilizando una lente de objetivo asférica de 30 × (5723-CH 30x, Newport Corporation, CA, EE. UU.) con una distancia focal de 6,2 mm. El rayo láser MPM enfocado en la muestra generó las señales SHG de las moléculas de las muestras, que fueron retrodispersadas y recolectadas por la lente del objetivo. Las señales SHG retrodispersadas se transmitieron luego a través del espejo dicroico, que se dirigió a una lente de tubo (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) con una distancia focal de 200 mm, filtro de paso de banda (FF01-794/32-25, IDEX Health & Science, LLC, Nueva York, EE. UU.) y lente doble acromática (AC254-050-B, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) con una distancia focal de 50 mm. Este haz se transmitió a un tubo fotomultiplicador (H7422-50, Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japón). Las señales convertidas eléctricamente se preamplificaron y luego se transmitieron a una computadora para su posterior procesamiento, a fin de obtener las imágenes MPM SHG de frente de la muestra. El sistema MPM tenía una resolución de aproximadamente ~ 1 µm. Con la configuración óptica indicada, se logró un FOV máximo de 300 × 300 µm.

Los sistemas de imágenes OCM y MPM se montaron en un microscopio (OLYMPUS-IX73, Olympus, Tokio, Japón) desde las direcciones superior e inferior, respectivamente, y los rayos láser OCM y MPM se alinearon coaxialmente. Las coordenadas x e y del ROI para el MPM de alta resolución se seleccionaron de la imagen OCM en face en tiempo real. Seleccionamos la coordenada de profundidad del ROI de la imagen OCM transversal correlacionada, que era la posición de profundidad para observar la respuesta fototérmica. La orientación lateral del ROI seleccionado para el MPM se implementó mediante el movimiento de traslación de una etapa de microposicionamiento (X e Y) (MCL-MOTNZ, Mad City Labs Inc., WI, EE. UU.). Luego, la luz de excitación del MPM se enfocó en la posición de profundidad del ROI al observar los cambios en la respuesta fototérmica mientras cambiaba la posición focal del MPM con respecto al movimiento axial incorporado del cuerpo del microscopio. El movimiento de traslación de la muestra se automatizó mediante el programa LabVIEW, mientras que el movimiento axial se controló manualmente.

Para evaluar y analizar la metodología y la solidez del sistema de imágenes MPM guiado por OCM multimodal PD-PT propuesto, se fabricaron dos muestras fantasma. Una de las muestras se preparó colocando un gel ultrasónico disponible comercialmente en un portaobjetos de vidrio de 1 mm y se apiló un cubreobjetos de 170 ± 5 µm de espesor sobre el gel ultrasónico, como se muestra en la Fig. 7a. Aquí se utiliza gel ultrasónico ya que sus propiedades térmicas son más estables y su conductividad térmica es cercana a los tejidos biológicos61. El espesor total de la muestra fabricada fue ~ 1500 μm, y el espesor del gel de ultrasonido introducido fue ~ 330 μm. De manera similar, desarrollamos una muestra fantasma de red compleja de varias capas para imitar estructuras de red complejas en tejidos biológicos, como se muestra en la Fig. 7b. Se usaron tejidos de lentes multicapa con un grosor total de ~ 300 µm y agua destilada en lugar del gel de ultrasonido, y el grosor total de la muestra fue de ~ 1470 µm. Se usó un epoxi de fraguado rápido para sellar el área que rodea el cubreobjetos en ambas muestras para evitar la evaporación del agua. La muestra se montó con un cubreobjetos orientado hacia el objetivo MPM, mientras que el portaobjetos de vidrio se orientó hacia el OCM, como se muestra en la Fig. 7a,b. Para demostrar la utilidad de la orientación de PD-PT OCM para ROI en una muestra biológica de gran volumen para imágenes de MPM, una muestra biológica (Ixodes dammini (garrapata de venado) hembra, wm Microscope Slide, Carolina Biological Supply, NC, EE. UU.) incrustada en un Se utilizó un portaobjetos de microscopio de 3 mm de largo y ancho (excluyendo algunas partes de las piernas). Para obtener las respuestas fototérmicas PD-PT OCM de las muestras ficticias y la muestra biológica, la posición de enfoque del objetivo MPM inicial se colocó 30 µm por debajo del cubreobjetos y la lente del objetivo MPM se movió axialmente hacia la muestra en incrementos de intervalo de paso de 10 µm. , como se muestra en la Fig. 7c. Con cada movimiento del objetivo MPM, el obturador mecánico se configuró para abrirse durante el período de tiempo deseado (350 ms, a menos que se indique lo contrario) para cada adquisición de señal PD-PT OCM. Los puntos de observación del OCM, donde se midieron las respuestas fototérmicas, se seleccionaron de los puntos dentro del ROI que proporcionaron la señal fototérmica apropiada. Principalmente, el intervalo de paso especificado aquí no es un valor absoluto que deba cumplirse estrictamente. Por ejemplo, se empleó un intervalo de paso de 20 µm para generar la respuesta fototérmica del espécimen biológico (Ixodes dammini hembra) representado en la Fig. 5. El intervalo de paso y las lecturas totales se pueden seleccionar de forma adaptativa en función de la composición y el grosor de la muestra.

Esquema de muestras fantasma y el protocolo experimental PD-PT OCM. (a) es la representación transversal esquemática de la muestra fantasma simple fabricada con gel de ultrasonido. (b) es una representación transversal esquemática de la muestra fantasma de red compleja fabricada con tejido de lente multicapa. c es la representación figurativa del posicionamiento objetivo de MPM para la metodología basada en PD-PT OCM. Figuras no dibujadas a escala.

Todos los datos necesarios requeridos para analizar y reproducir los resultados y las conclusiones presentadas en el manuscrito se proporcionan en las secciones correspondientes del manuscrito. Los detalles y datos adicionales relacionados con este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas de Corea [número de subvención D300300 y C330210], y el Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones (IITP) financiado por el gobierno de Corea (MSIT) [No. 1711152793].

Centro de Instrumentación Científica, Instituto de Ciencias Básicas de Corea, 169-148 Gwahak-ro Yuseong-gu, Daejeon, 34133, República de Corea

Naresh Kumar Ravichandran, Hwan Hur, Hyemi Kim, Sangwon Hyun, Ji Yong Bae, Dong Uk Kim, I Jong Kim, Ki-Hwan Nam, Ki Soo Chang y Kye-Sung Lee

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KSL desarrolló el concepto de diseño y co-desarrolló el sistema de imágenes. RNK co-desarrolló el sistema, realizó experimentos y procesó datos. RNK escribió el borrador del manuscrito. KSL y KSC revisaron críticamente el manuscrito. HK fabricó la muestra de biochip utilizada en la información complementaria. Todos los autores participaron en las discusiones y contribuyeron a la redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Ki Soo Chang o Kye-Sung Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ravichandran, NK, Hur, H., Kim, H. et al. Microscopía de coherencia óptica fototérmica sin etiquetas para ubicar las regiones deseadas de interés en imágenes multifotónicas de especímenes volumétricos. Informe científico 13, 3625 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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Recibido: 27 de octubre de 2022

Aceptado: 24 de febrero de 2023

Publicado: 03 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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